Khi nhỏ ông đã nổi tiếng là người hay chữ, học chữ mau nhớ, thông minh có tài đối ứng. Năm 1877, Đào Nguyên Phổ đi thi và đỗ cử nhân ở tuổi 17. Sau đó, một thời gian dài ông làm nghề dạy học ở gần nhà. Đến năm 1884, Đào Nguyên Phổ được bổ nhậm chức Giáo thụ huyện Tam Nông, tỉnh Phú Thọ, rồi Tri huyện Võ Giang, tỉnh Bắc Ninh và bị bãi chức vì để "mất trộm" tiền thuế của huyện. Ông lại đi dạy học ở Nam Định và giao du với các chí sĩ yêu nước.

Năm 1895, nghe theo lời khuyên của Nguyễn Thượng Hiền, ông vào Huế, học Trường Quốc Tử Giám. Đến Năm 1898, sau 3 năm học tại kinh đô, ông dự thi Hội và đỗ Đình nguyên Hoàng giáp. Ngay sau đó, ông được bổ chức Hàn lâm thừa chỉ. Nơi đế đô này, ông có cơ hội tiếp thu nhiều tư tưởng mới qua “Tân thư” và học thêm tiếng Pháp tại “Pháp tự quốc gia học đường” để mở rộng kiến văn. Ông được cho là nhà nho tiếp thu tư tưởng tư sản dân quyền đầu tiên ở nước ta khi ông làm quan tại Huế. Nhà ông là nơi có nhiều sách tân học nhất ở Việt Nam lúc bấy giờ.

Năm 1902, ông từ quan, ra Hà Nội làm nghề nhà báo, sau làm chủ bút tờ Đại Việt Tân Báo (1905), rồi Đăng Cổ Tùng Báo (1907) - tờ báo dùng quốc ngữ (đăng cùng phần chữ Hán) sớm nhất ở Bắc Kỳ, về sau được dùng làm cơ quan ngôn luận của Đông Kinh Nghĩa Thục.

Tham gia vào hoạt động của Đông Kinh Nghĩa Thục,  ngay từ khi trường còn trong trứng nước đến khi trường bị đóng cửa. Đào Nguyên Phổ đã rất tích cực đóng góp cả về trí tuệ lẫn công sức không nhỏ cho công cuộc canh tân văn hoá, cho hoạt động cách mạng công khai này.
Ngay tên trường cũng là theo đề nghị của Đào Nguyên Phổ, đến câu đối dán ở cửa trường được coi như tôn chỉ, mục đích hoạt động của trường cũng do Đào Nguyên Phổ viết. Ở Đông Kinh Nghĩa Thục, Đào Nguyên Phổ tham gia trong cả 2 ban : Ban Giáo dục và Ban Tư thư.
Ở Ban Giáo dục, mặc dù Đào Nguyên Phổ biết cả chữ Hán, Nôm, chữ Quốc ngữ và chữ Pháp nhưng uy tín lớn nhất của ông là ở phần chữ Hán vì ông viết chữ Hán rất bay, rất đẹp. Ở Ban Tu thư ông đã sáng tác rất nhiều bài thơ để làm tài liệu giảng dạy. Tiêu biểu là quyển sách " Âu học Hán tự tân thư".

Sau khi Đông Kinh Nghĩa Thục bị đóng cửa, tiếp đến vụ mưu sát và binh biến trong hàng ngũ bồi bếp và binh lính người Việt Nam phục vụ cho quân Pháp đóng ở thành Hà Nội (diễn ra ngày 27-6-1908, gọi là vụ Hà Thành đầu độc) bị thất bại, ông bị người Pháp truy lùng ráo riết. Trước tình hình nguy cấp đó, ông đã tự sát vào ngày 24-5 năm Mậu Thân (tức ngày 22-6-1908), hưởng dương 48 tuổi, để giữ trọn danh tiết và tránh liên lụy đến bạn bè, người thân.